Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител. РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата ¾ ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ.

Различают две основные разновидности метода: прямой и непрямой.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого или желтого цвета.

Непрямой метод РНИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген-антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из исследуемых микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты

Твердофазный ИФА является наиболее распростра­ненным вариантом ИФА, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микроплан­шетов из полистирола (рис. 27). При определении антител в лунки микроплан­шетов с сорбированными антигенами последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, субстрат для фермента (Н 2 О 2 или фосфатид) и хромоген (индикатор, окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента и хромоген.

Рис. 27. Принцип постановки ИФА для обнаружения антимикробных антител

Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)

Радиоиммунологический анализ (РИА) ¾высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­диоизотопами (l25 J, 14 С, 3 Н, 51 Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител. При твердофазном варианте РИАодин из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. При другом варианте метода ¾ конкурентном РИА ¾ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИАприменяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концент­рациях ¾ 10 -10 -10 -12 г/л.

Оглавление темы "Реакции преципитации (РП). Иммуноэлектрофорез. Сложные реакции иммунодиагностики.":

Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] - метод идентификации Аг (или AT) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют.

После отмывания несвязавшихся AT (при их наличии) проводят ИФА - на плёнку наносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к lg на носителе появляются окрашенные пятна (рис. 10-20).

Рис. 10-20. Иммуноблотинг

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ ) разработана А. Кунсом (1941) и основана на применении AT, меченных флюорохромными красителями. Такие AT, связывая различные Аг, вызывают свечение иммунных комплексов в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. На практике применяют несколько вариантов РИФ .

61. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение. Прямой и непрямой методы постановки.

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с ком­плементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.тБактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген-антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию - свечение.

Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем - меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ - меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ - меченые - АТ-комплемент.

Открытая еще в 1942 году Кунсом, реакция иммунофлуоресценции не является новым методом исследования. Однако появление гибридомных технологий, которые позволили получить моноклональные антитела, дало «вторую жизнь» этой реакции, поскольку их использование позволило в несколько раз увеличить чувствительность данной реакции и ее специфичность.

И сегодня мы расскажем вам в подробностях про реакцию прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) как метод диагностики Кунса для взрослых мужчин и женщин при беременности.

Что такое реакция иммунофлуоресценции

Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале. Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.

Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.

Кому ее назначают

Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:

• наличие в организме вируса ;
• заражение сальмонеллой;
• существование в организме определенных антигенов;
• выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
• диагностика вирусных болезней у животных.

Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.

Цели проведения

Поскольку данный метод диагностики имеет множество преимуществ, к которым следует отнести его высокую результативность, быстроту проведения и получения результата, а также отсутствие большого количества противопоказаний, с его помощью определяется наличие в организм вирусных инфекций. Поэтому назначать данный анализ могут как для постановки, так и для уточнения диагноза, на основании которого назначается схема лечения.

Проведение процедуры не вызывает неприятных ощущений, для нее необходимо получить материал для анализа, который берется из любой жидкости организма: слюны, мокроты, соскоб с поверхности слизистых оболочек. Также может для проведения анализа браться кровь. Частоту проведения реакции иммунофлуорсценции назначает лечащий врач, которому необходимо получить данные по динамике протекающих в организме процессов.

Поскольку вреда как для организма, так и для общего самочувствия человека данный анализ не несет, назначаться он может по необходимости.

Виды такой процедуры

Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.

К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:

1. — один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
2. ДНК-диагностика — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
3. иммунохромотография — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.

Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.

Показания к проведению

Реакция иммунофлуоресценции может назначаться для выявления в организме любого вида патологической среды.

Хламидии, трихомонады, гонококки и , а также лямблии всех видов определяются при проведении данного вида диагностики. и , и другие болезни также требуют проведения РИФ. Назначение врача для ее осуществления обязательно.

Противопоказания для проведения

Поскольку для проведения данной реакции в качестве исследуемого материала требуется любой вид жидкости организма, взятие их обычно не составляет трудностей и противопоказаний для осуществления реакции иммунофлуоресценции не существует. Однако при беременности и у детей до 6 месяцев взятие материала для исследования проводится с максимальными предосторожностями.

Отсутствие противопоказаний позволяет осуществлять проведение данного вида диагностики при назначении врача всем пациентам. Безопасность ее гарантируется использованием дезинфицированным инструментом и одноразовыми шприцами.

Подготовка к процедуре

Особенностей взятия материала для проведения данного анализа не существует. Кровь для него берется натощак, чтобы не было повышенного содержания в ней веществ, которые может изменить истинные показания и дать ложную картину.

Как проходит забор анализов

Поскольку особой подготовки для проведения анализа не требуется, исключается только прием пищи за 12 часов до ее проведения и отсутствие применения лекарственных препаратов, выполняется взятие исследуемого материала как обычный процесс взятия жидкости организма на анализ.

Субъективные ощущения во время процедуры могут различаться в зависимости от чувствительности.

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

• степень интенсивности флюоресценции;
• оттенок флюоресценции;
• периферический характер процесса свечения объекта;
• характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Средняя стоимость

Цена проведения реакции иммунофлуоресценции зависит от места ее проведения и уровня медицинского учреждения,а также квалификации проводящего анализ специалиста. Сегодня стоимость колеблется от 1280 до 2 160 рублей.

Более подробно о иммунологических реакциях поведает видео ниже:

РИФ

Реакция иммунофлюоресценции основана на взаимодействии противохламидийного АТ с родоспецифическим хламидийным антигеном. Существует два типа реакции иммунофлюоресценции - прямой и непрямой. В первом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования. Во втором случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса АГ-АТ, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к антихламидийным антителам. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.

Помимо импортных появились отечественные наборы для диагностики хламидийной инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.

Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8 - 10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5 - 10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1 - 0.15 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при -20°С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).

При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител в количестве, необходимом для полного покрытия мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при +37°С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.

При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител и проводят первую инкубацию в тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят второй реагент - меченые антитела к хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при +37°С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1 - 2 суток при +2-8°С в темном месте без доступа влаги.

Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:

1. Масляная иммерсия: На готовые высушенный препарат наносят 20 - 25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.

2. Водная иммерсия: на готовый препарат наносят каплю 20 мкл фосфатного буфера с рН 7.4 и микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л” - люминисцентный) с увеличением 60 и окуляром с увеличением 5. Водная иммерсия дает более ровное, яркое и четкое свечение.

РИФ позволяет выявлять антигенные структуры как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно внеклеточно, округлой формы с ровными краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое изумрудно-зеленое свечение, которое при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а, следовательно, к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.

Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения препарата. Результат считается положительным в том случае, если препарат содержит клетки эпителия и удается обнаружить не менее 6 элементарных телец, имеющих все вышеперечисленные признаки.

Обнаружение меньшего количества возбудителя делает результат сомнительным и требует повторного исследования, желательно на фоне провокации (пищевая - алкоголь, медикаментозная - инъекция пирогенала, механическая - массаж уретры на буже). Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через две недели, так как возможно сохранение не элиминированного антигенного материала нежизнеспособного возбудителя, что будет давать ложноположительные результаты. Получение 3 отрицательных результатов исследования у мужчин в течение месяца и у женщин в течение 3 менструальных циклов, отсутствие клинических проявлений хламидийной инфекции свидетельствует о выздоровлении.

РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 90 - 95% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, высокоинформативен, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (0.5 - 1 час) и визуально контролировать качество взятия материала для исследования.

Методы, использующие принципы молекулярной биологии

В группу входят методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют выявить генетический материал возбудителя в исследуемом биоматериале. Наборы для диагностики хламидиоза ДНК-зондами находятся пока на стадии разработки и клинических испытаний.

ПЦР активно внедряется в практику лабораторной диагностики. Метод основан на выделении специфической последовательности ДНК или РНК возбудителя при помощи комплементарных праймеров, последующего ее многократного копирования и накопления для дальнейшего выявления обычными методами детекции (электрофорез или ИФА). Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, практически приближающейся к культуральному и позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале. Метод ПЦР требует специального дорогостоящего оборудования, отдельной специально оснащенной лаборатории, соответствующей подготовки и высокой квалификации медицинского персонала. Вместе с тем, отсутствие сертификации используемых в России праймеров и достаточного опыта применения метода ПЦР, специфичность исследуемого материала, частая его контаминация сопутствующей микрофлорой (что может давать ложноположительные результаты) не позволяет однозначно судить о его ценности при диагностике урогенитального хламидиоза.

Таким образом, в настоящее время наиболее доступным, простым и в то же время высокоинформативным методом диагностики урогенитального хламидиоза и установления излеченности является реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Контроль за динамикой течения заболевания и эффективностью лечения следует проводить, определяя титр антихламидийных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).